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蛋白表达常见问题分析
发布人:viking2000    浏览 3594 次    时间:2012年12月19日    
      影响蛋白表达有许多因素,如目的蛋白自身的特点,表达载体、表达菌株的组合,诱导表达的条件,培养基的选择等,都有可能对蛋白的表达产生影响。针对蛋白表达中的一些常见问题,可尝试用如下方法加以解决。 

一、蛋白不表达或表达量很低 
1.选择正确的表达载体与表达菌株 
       基于T7 启动子的载体(如pET 系列载体)应选用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3) 等菌株不是基于T7 启动子的表达载体(如带有tac 启动子的pGEX、pMal 系列表达载体)应选用BL21 表达菌株。  
       对细胞有毒性的蛋白,应该选用背景表达低、严紧调控诱导的菌株,如BL21(DE3)pLysS 菌株。 对于带有稀有密码子的蛋白或来源于真核基因的蛋白,应该选用Rosetta(DE3) 等菌株。 
2.尝试不同的表达系统与菌株 
      不同的蛋白,对不同载体与菌株的偏好不同,如果某一表达系统无法通过优化诱导表达条件得到明显改善,可以更换其它的菌株或表达载体。 
3.表达条件的优化 
      选择不同的培养基。对于某些蛋白,在培养基中加入适量的葡萄糖(0.1%~0.5%),可以明显提高表达量。 
      较高的温度、较高的诱导物浓度、较长的表达时间,一般可以加快表达的速度,促进目的蛋白的积累,从而提高表达量。但是可能会降低可溶蛋白的表达量,形成包涵体。 
      菌体的生长状态对蛋白表达有很大的影响,可以通过测量菌液的OD 值监测生长状态。对于大部分蛋白,应在菌液的对数生长期(OD ≈ 0.5)进行诱导。 

二、目的蛋白不可溶,形成包涵体 
      首先确认目的蛋白是否有表达。裂解菌体并离心后,通过对全菌、上清、沉淀的检测,确认目的蛋白是否表达,还是形成了包涵体。 
      包涵体的形成与蛋白自身结构、表达系统、诱导表达条件等因素有着密切关系。在无法改变蛋白自身结构的情况下,可以尝试不同的表达系统与菌株,增强其溶解能力,优化出适合特定蛋白的表达系统。 
      目前认为包涵体的形成是基于蛋白在菌体内积累速度过快,没有正确折叠而聚集沉淀。可以通过优化诱导表达条件,减缓蛋白的积累。如:降低诱导温度、降低诱导物浓度、缩短表达时间、降低诱导时菌液的OD 值。
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发布人:viking2000 发布时间:2012年12月19日已被浏览 3594
 
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