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RNA提取常见问题分析
发布人:viking2000    浏览 1719 次    时间:2012年12月19日    
一、提取过程中RNA降解  
1、样品中的RNA发生降解 
尽量选择新鲜的样品,样品采集后应迅速用液氮处理。 
材料保存在液氮中或-80℃条件下,材料均不宜长期保存,且避免反复冻融。 
幼嫩新鲜的材料RNA含量高且完整,衰老或病害等受损的材料中RNA降解比较严重。
2、操作环境的RNase污染 
RNA提取尽量选择洁净的环境,由于自然条件下空气中含有较多的RNase,建议对提取环境进行RNase的清除处理。 
3、提取用具带来的RNase污染 
提取用所有的玻璃器皿可通过高温灭活(160℃烘烤4-5 h)去除RNase。 
RNA样品所接触的所有塑料制品(如枪头、电泳槽、移液器等都需要通过DEPC或NaOH处理严格去除RNase后才可使用 
4、RNA溶解用水带来的RNase污染 
配制DEPC处理水时需剧烈振荡使DEPC与水充分接触反应(DEPC与水反应后会产生大量的气体,可用塑料膜将瓶口扎紧,剧烈混匀后通过观察塑料膜是否胀气来判断反应是否充分)。 
DEPC处理后应避光静置过夜,高压灭菌。 
5、操作中带入的RNase污染 
人的皮肤、汗液和呼出的气体中含有大量的RNase。操作人员可通过经常更换一次性手套,佩戴口罩等措施减少此类污染。 

二、RNA提取量低 
材料RNA含量较低 
对于RNA含量较低的纤维组织(肌肉组织或纤维素较高的植物组织)可适当提高起始材料的用量。 
材料中蛋白和脂肪含量较高 
蛋白和脂肪含量较高的材料可用氯仿对上清再次抽提。  
RNA沉淀条件不合适 
使用异丙醇沉淀RNA中,加入的异丙醇与提取液的比例为严格的1 :1 ,否则会明显影响RNA沉淀的效率和RNA的纯度。特殊材料(如含有多糖、多酚等)可通过添加适量的柠檬酸钠来改善沉淀效果。 
RNA中有基因组DNA 污染 
材料中核酸含量高 
脾脏、胸腺等组织中的核酸含量较高,可进行多次酚氯仿抽 
提以去除多余的DNA。也可以在提取后加入DNase处理,降解DNA 。 
RNA沉淀条件不合适 
使用异丙醇沉淀RNA中,加入的异丙醇与提取液的比例偏高溶液的pH值偏小,都容易使DNA形成沉淀。 
提取后的RNA样品降解
RNA样品反复冻融 
反复冻融会使RNA片段断裂,影响RNA的完整性。 
RNA样品保存条件不合适 
根据保存时间和材料的不同RNA应保存在不同的溶液中。如从胰脏、肝脏等RNase含量较高的材料中提取的样品需要储存在甲醛或甲酰胺中以保存高质量的RNA,而在脾脏中提取的RNA可在水中长期稳定保存。,
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发布人:viking2000 发布时间:2012年12月19日已被浏览 1719
 
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