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蛋白印迹操作流程
发布人:viking2000    浏览 2737 次    时间:2012年12月19日    
蛋白印迹,也称Western,Western blot、Western blotting、Western印迹,简称WB,是用免疫学方法检测蛋白,研究蛋白质的表达调控的重要方法之一。蛋白印迹可以参考如下步骤进行操作。
    1.蛋白样品的制备(Protein sample preparation)
可以选用适当的裂解液,如赛驰生产的WIP细胞裂解液,裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行抽提,如赛驰生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。
    为确保每个蛋白样品的上样量一致,收集的蛋白样品均应测定其蛋白浓度。蛋白浓度的测定方法,应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用,因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。如使用我公司生产的WIP细胞裂解液,可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
    2. 电泳(Electrophoresis)
     (1)SDS-PAGE凝胶配制
    SDS-PAGE凝胶可以参考文献资料进行配制,也可以使用赛驰生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
     (2)样品处理
    在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,放置于水漂上于100℃或沸水浴中加热3-5分钟,以充分变性蛋白。使用浓缩的蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以加入更多的蛋白样品。蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料自行配制,也可以使用赛驰生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。
     (3) 上样与电泳
    冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可电泳,电泳缓冲液可以参考相关文献资料自行配制,也可以使用赛驰生产的SDS-PAGE蛋白电泳缓冲液(10X)。为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,最好使用预染蛋白质分子量标准 。电泳时通常在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可设置在120V左右。
    采用普通的电泳仪就可以满足SDS-PAGE电泳的要求,也可以采用赛驰提供的多功能电泳仪。为方便起见,也可整个SDS-PAGE电泳过程均采用恒压的方式,通常把电压设置在100V,然后设定时间为90-120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过冲。
    通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
    3. 转膜(Transfer)
    在Western实验中,我们推荐选用PVDF膜,也可以使用硝酸纤维素膜(NC膜),但硝酸纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商推荐的使用步骤。
    转膜时,通常可使用赛驰提供的多功能电泳仪。转膜电泳缓冲液可以参考相关文献资料自行配制,也可以使用赛驰生产的蛋白印迹转膜电泳缓冲液(10X)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短。如使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置,转膜电流可设定为300-400mA,转膜时间为30-60分钟或15-20mA于4℃转膜过夜。
    在转膜过程中,特别是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热现象,最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效果,通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色,以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝染色液对转膜后的PAGE胶进行染色,以观察蛋白的残留情况。
    4. 封闭(Blocking)
    转膜完毕后,立即把蛋白膜放置到预先准备好的WB洗涤液中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕起,以后所有的步骤均要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景。为减少液体使用量,避免干膜,您可以选用赛驰生物提供的杂交袋进行后续操作,可用巴斯特吸管吸尽洗涤液,加入WB封闭液,在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。如背景较高,可以在4℃ 封闭过夜。在整个Western过程中可使用侧摆摇床,侧向摆动速度比较缓慢,而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。
    5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
    参考一抗的说明书,按比例用WB一抗稀释液适当稀释一抗。用巴斯特吸管吸尽封闭液,不要漂洗,直接加入稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果效果不佳,可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗,加入WB洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,漂洗3-5次,每次5-10分钟。如果结果背景较高可以适当延长漂洗时间并增加漂洗次数。
    6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
    参考二抗的说明书,按照适当比例用WB二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用巴斯特吸管吸尽洗涤液,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗,加入WB洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,漂洗3-5次,每次5-10分钟。如果显色结果背景较高,可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
    7. 蛋白检测(Detection of proteins)
    检测结果可使用DAB染色试剂或氯萘酚染色试剂来检测蛋白,具体使用细节请参考赛驰生物相关产品说明书.
    8. 膜的重复利用(Membrane recovery)
    如果蛋白样品非常宝贵,可以使用WB抗体去除液处理蛋白膜,以重复利用蛋白膜。,
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发布人:viking2000 发布时间:2012年12月19日已被浏览 2737
 
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