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细胞表面抗原的流式检测
发布人:viking2000    浏览 2581 次    时间:2012年8月9日    

A.淋巴组织细胞或培养细胞表面抗原流式检测步骤

(一)细胞样品准备
收集组织或细胞
1. 取出目的组织(如:脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓等),迅速浸泡在Cell Staining Buffer (BioLegend Cat. #420201)中,并应用研磨及过滤等方法制备成单细胞悬液;如果为体外培养细胞,直接用Cell Staining Buffer重悬细胞后进行下一步操作。
2. 添加Cell Staining Buffer至约15mL,离心(350 x g)5分钟后弃去上清液。

裂解红细胞(脾脏组织等)
3. 如样品为脾脏组织细胞,需要裂解红细胞。把10X 红细胞裂解液(RBC Lysis Buffer ) (BioLegend Cat. #420301) 用去离子水稀释成1X工作液。然后用3 ml红细胞裂解工作液重悬细胞后,在冰上孵育5分钟。
4. 加入10 ml Cell Staining Buffer到管中;离心(350 x g)5分钟后弃去上清液。
5. 重复洗涤细胞一次(步骤2)。
6. 用Cell Staining Buffer重悬细胞后计数,稀释细胞为5-10 x 106细胞/ml,然后每支流式检测管中加入100uL细胞悬液(5-10 x 105 细胞/管)。

Fc受体封闭(可选)
7. Fc受体的封闭过程是为了减少抗体的非特异性结合造成的影响;对于小鼠细胞的检测,BioLegend公司的纯化抗小鼠 CD16/CD32 抗体特异识别并结合Fcγ R III/II (Cat. #101302, clone 93),适用于封闭抗体非特异染色;实验操作为用5-10 μg/ml纯化CD16/32抗体与细胞冰上孵育10分钟。而对于市面上没有可用的人或大鼠封闭抗体,可以采用加入无关纯化免疫球蛋白(如与所用荧光标记抗体相同种属和抗体亚型)到细胞样品中进行封闭。

(二)细胞表面荧光染色步骤
8. 在每个流式检测管中加入适量的预稀释好的一抗(荧光标记抗体、生物标记抗体或纯化抗体);在空白管/孔或同型对照管/孔中加入与抗体相同量的对照试剂。然后各管避光冰浴或在4℃冰箱中孵育15-20分钟。(注:有些抗体可能需要更长的孵育时间,建议实验者进行预试验摸索)
9. 加入至少2mL Cell Staining Buffer,然后350g离心5分钟后弃去上清液;重复洗涤过程两次。
10.(间接标记)若使用的一抗是纯化或生物素标记抗体,则每管/孔加入适量稀释好的荧光标记二抗或荧光标记亲和素(SAv-PE, BioLegend Cat. # 405204)后于冰浴或在4℃冰箱中避光孵育15-20分钟。
11. 重复洗涤细胞一次(按步骤9)。
12. 用0.5 ml Cell Staining Buffer 重悬细胞;如有必要,加入10uL(0.25 μg)/million细胞的核染料7-AAD(BioLegend Cat. #420401)以区分活、死细胞,冰上孵育3-5分钟。(注:我们不建议7-AAD与PE-Cy5 或 PE-Cy7等荧光标记抗体联用)13.上机检测并分析结果。

B.全血细胞表面抗原的流式检测步骤

1.往含有100uL抗凝全血的流式检测管中加入适量的预稀释好的一抗(荧光标记抗体、生物标记抗体或纯化抗体)。
2. 室温避光孵育15-20分钟。(注:有些结合能力较低的抗体可能需要更长的孵育时间,建议实验者进行预试验摸索)
3.把10X 红细胞裂解液(RBC Lysis Buffer ) (BioLegend Cat. #420301) 用去离子水稀释成1X工作液,用之前恢复至室温。加入2 ml 红细胞裂解工作液到含全血/一抗的检测管中,室温孵育10分钟。
4.350g离心5分钟后弃去上清液。
5.加入至少2mL Cell Staining Buffer,然后350g离心5分钟后弃去上清液。
6.(间接标记)若使用的一抗是纯化或生物素标记抗体,则每管/孔加入适量稀释好的荧光标记二抗或荧光标记亲和素(SAv-PE, BioLegend Cat. # 405204)后室温避光孵育15-20分钟。
7.重复洗涤细胞一次(按步骤5)。
8.用500ul Staining Buffer或500ul 2%的多聚甲醛固定液重悬细胞。
9.上机检测并分析结果。

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发布人:viking2000 发布时间:2012年8月9日已被浏览 2581
 
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