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细胞内因子的流式检测
发布人:viking2000    浏览 2112 次    时间:2012年8月9日    

一、基本原理

  细胞因子是可溶性小分子蛋白或者多肽,在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活,只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子,静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。

  胞内流式细胞术的发展是基于Jung与Picker采用monensin,PMA,BFA和Monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法刺激T细胞活化,阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集,蓄积,增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。

  胞内流式细胞术具有其它方法难以比拟的优点:快速,简便,灵敏度高,高效,安全,接近生物体的分析条件。

二、实验材料

(1)实验设备
1)流式上样管及细胞培养皿或板
2)25%CO2,37℃孵箱
3)混匀振荡器
4)离心机
5)移液器、Tips
6)流式细胞仪

(2)所需试剂
1)荧光标记的细胞表面分子及胞内因子的单抗试剂
(Biolegend公司提供品种丰富的不同荧光标记的抗体,详情可以直接在达科为网站搜索,或者登陆biolegend的网站www.biolegend.com)
2)红细胞裂解液RCL buffer(Biolegend Cat. #420301)
3)激活剂
根据检测指标和标本的不同,需要选择不同的刺激剂和刺激时间,最常用为Ionomycin,PMA和PHA。
4)阻断剂:
Brefeldin-A (Biolegend 1000x Cat. #420601, 使用前稀释到1X)
或者 Monensin (Biolegend 1000x Cat. #420701,使用前稀释到1X)
Brefeldin-A为Goligiplug,能破坏高尔基体的形成,抑制细胞因子的分泌。一般检测TNF-α,IL-6,Il-12.MCP-1的效果较好。
Monensin 为Goligistop,抑制细胞因子穿过膜。一般检测IL_3,IL-4,IL-5,IL-1,Il-13效果较好。
5)固定剂Fixation buffer( Biolegend Cat. #420801)
含4%的多聚甲醛PBS溶液,室温保存。
6)破膜剂Permeabilization buffer( Biolegend Cat. #421001)
含1%皂甙, 4℃储存。
7)Cell staining buffer
主要为FBA或者BSA,两者相差不大,一般是FBA,特殊情况可选择BSA。

三、常用的标本类型和处理方法

1、全血
  使用肝素钠抗凝,不易采用肝素锂,EDTA和ACD抗凝剂,血样在8小时内分析。如不能在8小时之内检测,应将真空采血管水平室温放置。

2、外周血单个核细胞或者细胞系与T细胞克隆
  调节细胞浓度2×106细胞/mL于含10%FBS 的PMI-1640培养基中。

四、对照

  正确的系统对照可以减小误差。当试验结果正确时,可以省略激活对照与胞内染色对照,但是每次实验都需要做未刺激与同型对照。

1、 未刺激对照
样品不加刺激剂,用于评价体外激活过程中生成的细胞因子水平。

2、 同型对照
  与一抗相同来源,相同亚型或亚链,相同荧光标记的抗体,用于检测细胞与抗体非特异结合所至非特异染色。

3、 激活对照
  如用CD69细胞表面染色,如果未达到CD69期望的水平,则激活步骤出了问题,某一试剂可能失活,过期,制备不当或溶剂污染。

4、 胞内染色对照
  如用胞内CD69染色与激活对照结果比较来评价通透与胞内染色是否正确进行。如果激活对照阳性率大于90%而胞内CD69未达到相应水平,则通透与胞内染色可能步骤出了问题。

五、实验步骤
(以Biolegend产品检测全血样本的胞内因子为例)
1.往刺激处理的全血中,每管加入1-2mL 1Xred blood cell lysis buffer(使用前,先从冰箱里面取出,用无菌水稀释,恢复到室温),振荡混匀,RT(室温), 避光孵育5~10min。
2.离心,350g,5min,弃上清。
3.每管加入1-2 mL Cell staining buffer洗涤细胞,350g,5min 离心。
4.分别加入0.25ug表面标记分子抗体, RT,避光孵育15-20min
5.每管加入0.25-0.5mL fixation buffer, RT,避光孵育20min。
6.离心,350g,5min,弃上清
7.每管加入1-2 mL 1Xpermeabilization wash buffer,350g,5-10min,弃上清。
8.重复步骤7洗涤细胞两次
9.加入100uL permeabilization wash buffer重悬细胞,分别加入对应的0.25-0.5ug胞内因子抗体,RT 避光孵育20min。
10.每管加入1-2ml的1X Permeabilization wash buffer 洗涤细胞两次,350g,5min.
11.每管加入0.5ml Cell staining buffer重悬,上机检测。

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发布人:viking2000 发布时间:2012年8月9日已被浏览 2112
 
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